А Б В Г Д Е Є Ж З І Ї Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Ю Я
Розділений речовина
Розділені речовини на ТШХ можуть бути виявлені і ідентифіковані колориметрическим або іншими фізико-хімічними методами.
Розділені речовини елюіруются з хроматографічної колонки потоком газу-носія, реєструються детектором і фіксуються на хроматограмі у вигляді піків. Отримана хроматограмма служить основою для якісного і кількісного аналізу суміші речовин. Метод газової хроматографії застосовується для аналізу летючих речовин або речовин, які можуть бути переведені в летючі за допомогою спеціальних прийомів і пристроїв в пароподібний стан.
Розділені речовини, потрапляючи в полум'я, частково де-сорбируются, частково розкладаються: отримані продукти відразу детектируют, оскільки джерелом локального нагріву в даному випадку виступає сам детектор. На результати детектування впливає ряд параметрів: розміри хроматограми пластинки; товщина шару сорбенту; розташування хроматограми в полум'я; швидкість переміщення хроматограми в полум'я.
Якщо розділення речовини володіють власною забарвленням або флуоресцируют при опроміненні УФ-світлом, то після хроматографічного поділу їх можна просто виявити.
Інтегральні показники приладу, отримані з використанням різних фільтрів. Дуже часто розділені речовини, хоча і близькі за властивостями, мають різні забарвлення, так що може бути підібраний відповідний фільтр. Алкалоїди мітрагіни утворюють сполуки від червонувато-фіолетових до темних червонувато-коричневих Івета, якщо їх нагрівати з хлоридом заліза і хлорного кислотою.
Щоб ідентифікувати розділені речовини, елюіровать з пластинки, застосовуючи методи спектроскопії, використовують виготовлені вручну скляні пластинки з нанесеним шаром силікагелю Merck Silica Gel HF254 або HR, так як ці адсорбенти, як було показано, майже не містять органічних забруднень.
Для ідентифікації розділених речовин успішно застосовується безліч хімічних реакцій з органічними реагентами. Такі реакції, хоча логічно вони здійсненні, мають то незручність, що зона при випробуванні вже більше не може бути приведена до свого первісного вигляду; з іншого боку, перевага спектроскопічного дослідження компонентів суміші полягає в тому, що хімічні реакції можуть бути виконані пізніше, якщо це буде потрібно.
Тоді зони розділених речовин з RJ 0 5 наблизяться до фронту (R f 1), що означає відсутність поділу. В цьому випадку отримується з хромато-грами як якісна, так і кількісна інформація стає ненадійною. Використання сендвіч-камери з ненасиченої газової атмосферою в типово адсорбційної хроматографії дозволяє проводити поділ в кращих умовах. Як відомо, механізм рас-ділення на тонкому шарі силікагелю здебільшого є проміжним між адсорбційним і розподільним.
Виявлення зон розділених речовин на хроматограмі зазвичай проводиться обприскуванням відповідними розчинами, що дають кольорові або люмінесцентні реакції з їх відкриває іонами.
Для виявлення розділених речовин на шарах сефадексе його можна обробити безпосередньо, як описано раніше; можна також притиснути до шару смужку вологого фільтра і витримувати 40 - 50 хв. Папір потім видаляють, сушать і обприскують реактивом для виявлення.
Схема приладу Виланда і Фішера для електрофорезу на папері. | Скляний пульверизатор для кроплення паперових хроматограм. Для дослідження розділених речовин користуються тими ж якісними реакціями та кількісними методами, які описані у відповідних розділах цієї книги. Для прояви паперових хроматограм їх оббризкують спеціальними реактивами, склад яких наводиться нижче при описі окремих методів аналізу. Для кроплення користуються спеціальним пульверизатором. Оббризкують рівномірно і рясно, але не до такої міри зволоження, щоб розчин почав капати з паперу. Зазвичай кроплення проводять під тягою. На рис. 237 зображений добре зарекомендував себе скляний пульверизатор.
Кількісне визначення хроматографически розділених речовин може бути виконано двома шляхами: або речовина видаляється з адсорбенту, а потім визначається, або кількісне визначення проводиться безпосередньо на шарі сорбенту.
Універсальний спосіб детектування розділених речовин полягає в тому, що при приготуванні пластинок до адсорбенти додають неорганічний фосфор і таким чином отримують флуоресцирующие пластинки. Оскільки органічні речовини найчастіше гасять флуоресценцію, то в ультрафіолетовому світлі вони виявляються у вигляді темних плям. Якщо речовини самі флуоресцируют, то під впливом УФ-випромінювання вони виявляються у вигляді світлих плям на темному тлі.
Кількісне визначення хроматографически розділених речовин може бути виконано двома способами: видаленням речовини з адсорбенту з подальшим кількісним його визначенням; кількісним визначенням безпосередньо на шарі сорбенту. Другий спосіб більш чутливий.
Якщо виділення хроматографически розділених речовин з їх суміші з газом-носієм супроводжується утворенням туману, то цього можна уникнути за допомогою чисто термічних методів. В основі всіх цих методів лежить рівняння (4.2), і всі вони пов'язані з підтриманням молекул улавливаемого речовини в перегрітому стані аж до їх остаточного контакту зі стенкмі судини.
Для заданої чистоти розділених речовин існує певний діапазон значень відношення швидкостей потоків газу і рідини, який залежить від числа теоретичних тарілок в колонці.
Повна ідентифікація хроматографически розділених речовин про застосуванням переривчастого злюі-вання і пиролитической ГХ.
При отриманні мас-спектра розділеного речовини десорбується-ний розчин вводять шприцом через прокладку безпосередньо в пристрій для введення зразка в мас-спектрометр.
Раздезхеніе ефірів п-оксибензойной кнсдоти. а на сілікагене КСЕ. б на Оілоксілюне. У першому випадку - розділені речовини можуть бути виділені в чистому вигляді для препаративних цілей, крім того, чутливість методу значно вище.
Для виявлення і виділення розділених речовин застосовують добре розроблені методи, використовувані при хроматографування на папері, включаючи методи двовимірного розподілу. Слід зазначити, що методи хроматографії та електрофорезу на папері засновані на абсолютно різні властивості речовин, що розділяються і доповнюють один одного. Тому кращі результати дає поєднання цих двох методів. Найбільш широке застосування електрофоретичний метод отримав в біохімії, зокрема, для поділу сироваткових білків, гідролізату нуклеїнових кислот, амінокислот і пептидів.
Простий пристрій для радіальної хроматографії. У плямах і смугах розділених речовин після обприскування платівки спеціальною сумішшю реагентів йдуть хімічні реакції, що призводять до розвитку забарвлення, що дозволяє не тільки візуально виявляти плями, але і оцінювати зміст в них речовин спектрофотометріческн - за інтенсивністю поглинання світла певної довжини хвилі. Сучасні скануючі денситометри (з монохроматором або набором фільтрів) працюють у відбитому світлі, що дозволяє виключити поглинання в скляній підкладці і денсітометріровать плями на платівках з непрозорою підкладкою.
Для виявлення і виділення розділених речовин застосовують добре розроблені методи, використовувані при хроматографування на папері, включаючи методи двовимірного розподілу. Слід зазначити, що методи хроматографії та електрофорезу на папері засновані на абсолютно різні властивості речовин, що розділяються ж доповнюють один одного. Тому кращі результати дає поєднання цих двох методів. Найбільш широке застосування електрофоретичний метод отримав в біохімії, зокрема, для поділу сироваткових білків, гідролізату нуклеїнових кислот, амінокислот і пептидів.
Змінити хімічним шляхом природу частково розділених речовин перед проявом у другому напрямку з використанням колишніх нерухомої і рухомої фаз.
В окремих випадках для локалізації розділених речовин можна використовувати такі реактиви, які не заважають подальшого застосування (після екстракції плям) другий кольоровий реакції, необхідної для колориметрического визначення. Для другої кольорової реакції застосовують інший реактив, який діє на іншу функціональну групу визначається з'єднання. Так можна розділяти ефіри жирних кислот, локалізувати їх парами йоду і після прояву кількісно визначити колориметрически, перевівши ефіри в пофарбовані залізні комплекси гід-роксамових кислот[37](Див. Стор. Відтворюваність методу була перевірена на суміші метилових ефірів пальмітинової, 6-оксистеаринової і 910-діоксістеаріновой кислот. Цим же методом були проаналізовані суміші моно -, ді - і тригліцеридів[37](Пор. Гліколіпо-ідние фракції липоидов мозку були пофарбовані аміачним розчином бром-тимолового і визначені колориметрически після екстракції антронсерной кислотою[17](Пор. Фракції ліпідів людської плазми[11]І сфінгоміеліновие компоненти липоидов мозку[17]Були пофарбовані на хроматограмі аміачним розчином бромтимолового синього і Озол, і потім в їх зоні колориметрически визначено вміст фосфору (пор.
На шарі сорбенту локалізують зони розділених речовин і навколо обумовленою зони повністю видаляють сорбент, знімаючи його з пластіпкі борозенкою в формі кільця. В утворену виїмку поміщають еластичну і непровідну прокладку, а до неї прикріплюють полярографическую осередок оригінальної форми так, щоб її нижня площина щільно прилягала до поверхні шару сорбенту. В утворену порожнину подають відповідний електроліт і проводять далі визначення звичайним способом. Обсяг електролітичної осередки, утвореної скляної підкладкою, ізолюючої прокладкою (наприклад, із силіконової гуми) і поверхнею держателя електродів, становить 100 - 200 мкл. Робочий електрод виготовляють переважно з вуглецевої ласти.
Відомий ряд пристроїв для детектування розділених речовин безпосередньо на ТШХ-платівці. Ді Сте-Фано і Марини[18]запропонували кондуктометрический детектор для паперової, тонкошарової та колонкової хроматографії. Міст Уітсто-на пов'язаний з підсилювачем, вихідний сигнал якого надходить на самописець.
Встановлюють температуру випарника і відбору розділених речовин і температуру колонки.
Другий спосіб передбачає попереднє виморожування розділених речовин з елюата (з використанням мікропрепаратівних методів) і їх подальше нанесення на старт тонкошарової пластинки.
В окремих випадках для локалізації розділених речовин можна використовувати такі реактиви, які не заважають подальшого застосування (після екстракції плям) другий кольоровий реакції, необхідної для колориметрического визначення. Для другої кольорової реакції застосовують інший реактив, який діє на іншу функціональну групу визначається з'єднання. Так можна розділяти ефіри жирних кислот, локалізувати їх парами йоду і після прояву кількісно визначити колориметрически, перевівши ефіри в пофарбовані залізні комплекси гід-рок Самовіа кислот[37](Див. Стор. Відтворюваність методу була цроверена на суміші метилових ефірів пальмітинової, 6-оксистеаринової і 910-діоксістеаріновой кислот. Цим же методом були проаналізовані суміші моно -, ді - і тригліцеридів[37](Пор. Гліколіпо-ідние фракції липоидов мозку були пофарбовані аміачним розчином бром-тимолового і визначені колориметрически після екстракції антронсерноі кислотою[17](пор. Фракції ліпідів людської плазми[11]і сфінгоміеліновие компоненти липоидов мозку[17]були пофарбовані на хроматограмі аміачним розчином бромтимолового Синього і Озол, і потім в їх зоні колориметрически визначено вміст фосфору (пор.
Хроматограмма суміші пестицидів, записана за допомогою рефрактометричних детектора (розчинник - ізооктан. витрата 0 8 мл /хв. колонка довжиною 1 2 м. Оскільки випливає з колонки розчинник містить розділені речовини, багато з яких мають специфічні групи, здатні поглинати, для детектування був запропонований ряд спектральних методів, заснованих на вимірах поглинання світла речовиною в певній частині спектра, наприклад в ультрафіолетовій або інфрачервоної області. Оскільки детектування проводиться безперервно і неможливо здійснити вимір у всьому спектрі поглинання, знімають лише поглинання при фіксованій довжині світлової хвилі, яку вибирають таким чином, щоб детектор був придатний для вимірювання можливо більшої кількості речовин.
Якщо, проте, можна локалізувати розділені речовини без їх подальшого перетворення, наприклад за їхньою власною флуоресценції або з поглинання в ультрафіолеті на пластинках, покритих флуоресцирующим складом, і якщо після екстракції речовини є в кількостях, достатніх для застосування фізико-хімічних методів визначення, то цю можливість зазвичай використовуватись.
Хроматограмма суміші пестицидів, записана за допомогою рефрактометричних детектора ( розчинник - ізооктан, витрата 0 8 мл /хв. колонка довжиною 1 2 м. Оскільки випливає з колонки розчинник містить розділені речовини, багато з яких мають специфічні групи, здатні поглинати, для детектування був запропонований ряд спектральних методів, заснованих на вимірах поглинання світла речовиною в певній частині спектра, наприклад в ультрафіолетовій або інфрачервоної області. Оскільки детектування проводиться безперервно і неможливо здійснити вимір у всьому спектрі поглинання, знімають лише поглинання при фіксованій довжині світлової хвилі, яку вибирають таким чином, щоб детектор був придатний для вимірювання можливо більшої кількості речовин.
Якщо, проте, можна локалізувати розділені речовини без їх подальшого перетворення, наприклад за їхньою власною флуоресценції або з поглинання в ультрафіолеті на пластинках, покритих флуоресцирующим складом, і якщо після екстракції речовини є в кількостях, достатніх для застосування фізико-хімічних методів визначення, то цю можливість зазвичай слід використовувати.
Дуже часто для отримання достатньої кількості розділених речовин потрібно кілька разів повторювати один і той же цикл поділу. У зв'язку з цим великі зусилля були витрачені на автоматизацію процесу збору розділених речовин. На жаль, така автоматизація можлива лише в разі відносно простих розділень, які виконуються за допомогою звичайних методів. Суміші ж, використовувані в дослідних лабораторіях, часто настільки цінні, що втрати розділених речовин, що відбуваються при переключення автоматичного пристрою для відбору фракцій, абсолютно неприпустимі. Успішна автоматизація можлива лише в разі абсолютно стабільною нульової лінії детектора. Програмування температури колонки ще більше ускладнює справу. Розглянемо, наприклад, хроматограму поділу ефірного масла, наведену на рис. 722. Якщо пороговий рівень - перемикання пристрою для відбору фракцій встановити на рівні, рівному 5% повного відхилення пера самописця (це не такий вже високий рівень), то буде втрачено можливість відбору малих хромато-графічних піків. Можна встановити різні рівні для різних піків, але це очевидно можна зробити лише після ретельного хроматографирования даної суміші.
Другою важливою технічною проблемою є уловлювання розділених речовин при великих витратах газу-носія.
Існує й інший універсальний спосіб детектування розділених речовин. При приготуванні пластинок для тонкошарової хроматографії до адсорбентів додають неорганічний фосфор і таким чином отримують флуоресцирующие пластинки.
Уловлювання та збір на виході колонки вже розділених речовин представляє деякі труднощі. Розділені речовини знаходяться в паровій фазі, для уловлювання їх необхідно скондесувати. На виході колонки для цього використовують спеціальні збірники фракцій, що представляють собою ємності, заповнені інертним насадкою. Збірник охолоджується будь-яким хладоагентом, найчастіше рідким азотом. Незважаючи на низьку температуру, при якій відбувається збір фракцій, повна конденсація зазвичай не досягається. При різкому охолодженні частина речовини несеться у вигляді туману або кристаликів потоком газу-носія.
Що випливає з колонки потік розчинника з розділеними речовинами потрапляє насамперед у вузол дозування, в якому відміряються дози певної величини для подальшої подачі в систему пробірок для збору фракцій. Дозування може здійснюватися але обсягом, за вагою або за часом. Дозування за об'ємом здійснюється або з використанням сифона, обсяг якого строго заданий і може змінюватися лише з заміною осередки, або з використанням дозування зі зміною положення по висоті контакту для електропровідних розчинів з відкриванням крана в момент замикання ланцюга. При дозуванні за часом через задані проміжки часу відбувається переміщення пробірок для збору фракцій.
Що випливає з колонки потік розчинника з розділеними речовинами потрапляє насамперед у вузол дозування, в якому відміряються дози певної величини для подальшої подачі в систему пробірок для збору фракцій. Дозування може здійснюватися за обсягом, за вагою або за часом. Дозування за об'ємом здійснюється або з використанням сифона, обсяг якого строго заданий і може змінюватися лише з заміною осередки, або з використанням дозування зі зміною положення по висоті контакту для електропровідних розчинів з відкриванням крана в момент замикання ланцюга. При дозуванні за часом через задані проміжки часу відбувається переміщення пробірок для збору фракцій.
Як уже згадувалося, недоцільно проводити фарбування розділених речовин на хроматограмі, після чого пофарбовані речовини екстрагувати і фотометріровать. Проте цей метод був використаний Бар-Рольє[2]при кількісному поділі амінокислот по Бреннеру і Нідер-Визеру[31, причем, по-видимому, с успехом. Данные о воспроизводимости этого метода анализа не приведены.
Кроме перечисленных выше методов для идентификации хроматографически разделенных веществ, могут быть использованы кулонометрия, полярография, спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях, обычный анализ элементарного состава и др. При отсутствии перечисленных дорогостоящих приборов во многих случаях можно воспользоваться классическими методами качественного анализа.
Как уже упоминалось, нецелесообразно проводить окрашивание разделенных веществ на хроматограмме, после чего окрашенные вещества экстрагировать и фотометрировать. Тем не менее этот метод был использован Бар-ролье[2]при кількісному поділі амінокислот по Бреннеру і Нідер-Визеру[3], Причому, мабуть, з успіхом.
Схема приладу для безперервної ГЖРХ, описаного Шут-те і Коендерсом. Шутт і Коендерс розробили систему, в якій розділені речовини розчиняються в потоці сцінтіл-тора.
На рухомий шар наносять пробу, поділяють, розділене речовина видаляють з стрічки і, нарешті, використаний адсорбент соскребают.
Потім в цих фракціях виявляють або кількісно визначають розділення речовини відповідними хімічними або фізичними методами. При знятті такої рідкої хроматограми більш сильно адсорбовані речовини з'являються в елюаті пізніше, ніж менш сильно адсорбовані.
Для елюціі вибирають такий розчинник, в якому розділені речовини добре розчинні і стійкі. Вода (якщо необхідно, з добавкою кислоти або аміаку) служить прекрасним розчинником, якщо тільки задовольняє обом цим умовам. Якщо необхідно скористатися менш полярними розчинниками, слід брати до уваги адсорбцію речовини.
Потім в цих фракціях виявляють або кількісно визначають розділення речовини відповідними хімічними або фізичними методами. При знятті такої рідкої хроматограми більш сильно адсорбовані речовини з'являються в елюаті пізніше, ніж менш сильно адсорбовані.
Розділені речовини елюіруются з хроматографічної колонки потоком газу-носія, реєструються детектором і фіксуються на хроматограмі у вигляді піків. Отримана хроматограмма служить основою для якісного і кількісного аналізу суміші речовин. Метод газової хроматографії застосовується для аналізу летючих речовин або речовин, які можуть бути переведені в летючі за допомогою спеціальних прийомів і пристроїв в пароподібний стан.
Розділені речовини, потрапляючи в полум'я, частково де-сорбируются, частково розкладаються: отримані продукти відразу детектируют, оскільки джерелом локального нагріву в даному випадку виступає сам детектор. На результати детектування впливає ряд параметрів: розміри хроматограми пластинки; товщина шару сорбенту; розташування хроматограми в полум'я; швидкість переміщення хроматограми в полум'я.
Якщо розділення речовини володіють власною забарвленням або флуоресцируют при опроміненні УФ-світлом, то після хроматографічного поділу їх можна просто виявити.
Інтегральні показники приладу, отримані з використанням різних фільтрів. Дуже часто розділені речовини, хоча і близькі за властивостями, мають різні забарвлення, так що може бути підібраний відповідний фільтр. Алкалоїди мітрагіни утворюють сполуки від червонувато-фіолетових до темних червонувато-коричневих Івета, якщо їх нагрівати з хлоридом заліза і хлорного кислотою.
Щоб ідентифікувати розділені речовини, елюіровать з пластинки, застосовуючи методи спектроскопії, використовують виготовлені вручну скляні пластинки з нанесеним шаром силікагелю Merck Silica Gel HF254 або HR, так як ці адсорбенти, як було показано, майже не містять органічних забруднень.
Для ідентифікації розділених речовин успішно застосовується безліч хімічних реакцій з органічними реагентами. Такі реакції, хоча логічно вони здійсненні, мають то незручність, що зона при випробуванні вже більше не може бути приведена до свого первісного вигляду; з іншого боку, перевага спектроскопічного дослідження компонентів суміші полягає в тому, що хімічні реакції можуть бути виконані пізніше, якщо це буде потрібно.
Тоді зони розділених речовин з RJ 0 5 наблизяться до фронту (R f 1), що означає відсутність поділу. В цьому випадку отримується з хромато-грами як якісна, так і кількісна інформація стає ненадійною. Використання сендвіч-камери з ненасиченої газової атмосферою в типово адсорбційної хроматографії дозволяє проводити поділ в кращих умовах. Як відомо, механізм рас-ділення на тонкому шарі силікагелю здебільшого є проміжним між адсорбційним і розподільним.
Виявлення зон розділених речовин на хроматограмі зазвичай проводиться обприскуванням відповідними розчинами, що дають кольорові або люмінесцентні реакції з їх відкриває іонами.
Для виявлення розділених речовин на шарах сефадексе його можна обробити безпосередньо, як описано раніше; можна також притиснути до шару смужку вологого фільтра і витримувати 40 - 50 хв. Папір потім видаляють, сушать і обприскують реактивом для виявлення.
Схема приладу Виланда і Фішера для електрофорезу на папері. | Скляний пульверизатор для кроплення паперових хроматограм. Для дослідження розділених речовин користуються тими ж якісними реакціями та кількісними методами, які описані у відповідних розділах цієї книги. Для прояви паперових хроматограм їх оббризкують спеціальними реактивами, склад яких наводиться нижче при описі окремих методів аналізу. Для кроплення користуються спеціальним пульверизатором. Оббризкують рівномірно і рясно, але не до такої міри зволоження, щоб розчин почав капати з паперу. Зазвичай кроплення проводять під тягою. На рис. 237 зображений добре зарекомендував себе скляний пульверизатор.
Кількісне визначення хроматографически розділених речовин може бути виконано двома шляхами: або речовина видаляється з адсорбенту, а потім визначається, або кількісне визначення проводиться безпосередньо на шарі сорбенту.
Універсальний спосіб детектування розділених речовин полягає в тому, що при приготуванні пластинок до адсорбенти додають неорганічний фосфор і таким чином отримують флуоресцирующие пластинки. Оскільки органічні речовини найчастіше гасять флуоресценцію, то в ультрафіолетовому світлі вони виявляються у вигляді темних плям. Якщо речовини самі флуоресцируют, то під впливом УФ-випромінювання вони виявляються у вигляді світлих плям на темному тлі.
Кількісне визначення хроматографически розділених речовин може бути виконано двома способами: видаленням речовини з адсорбенту з подальшим кількісним його визначенням; кількісним визначенням безпосередньо на шарі сорбенту. Другий спосіб більш чутливий.
Якщо виділення хроматографически розділених речовин з їх суміші з газом-носієм супроводжується утворенням туману, то цього можна уникнути за допомогою чисто термічних методів. В основі всіх цих методів лежить рівняння (4.2), і всі вони пов'язані з підтриманням молекул улавливаемого речовини в перегрітому стані аж до їх остаточного контакту зі стенкмі судини.
Для заданої чистоти розділених речовин існує певний діапазон значень відношення швидкостей потоків газу і рідини, який залежить від числа теоретичних тарілок в колонці.
Повна ідентифікація хроматографически розділених речовин про застосуванням переривчастого злюі-вання і пиролитической ГХ.
При отриманні мас-спектра розділеного речовини десорбується-ний розчин вводять шприцом через прокладку безпосередньо в пристрій для введення зразка в мас-спектрометр.
Раздезхеніе ефірів п-оксибензойной кнсдоти. а на сілікагене КСЕ. б на Оілоксілюне. У першому випадку - розділені речовини можуть бути виділені в чистому вигляді для препаративних цілей, крім того, чутливість методу значно вище.
Для виявлення і виділення розділених речовин застосовують добре розроблені методи, використовувані при хроматографування на папері, включаючи методи двовимірного розподілу. Слід зазначити, що методи хроматографії та електрофорезу на папері засновані на абсолютно різні властивості речовин, що розділяються і доповнюють один одного. Тому кращі результати дає поєднання цих двох методів. Найбільш широке застосування електрофоретичний метод отримав в біохімії, зокрема, для поділу сироваткових білків, гідролізату нуклеїнових кислот, амінокислот і пептидів.
Простий пристрій для радіальної хроматографії. У плямах і смугах розділених речовин після обприскування платівки спеціальною сумішшю реагентів йдуть хімічні реакції, що призводять до розвитку забарвлення, що дозволяє не тільки візуально виявляти плями, але і оцінювати зміст в них речовин спектрофотометріческн - за інтенсивністю поглинання світла певної довжини хвилі. Сучасні скануючі денситометри (з монохроматором або набором фільтрів) працюють у відбитому світлі, що дозволяє виключити поглинання в скляній підкладці і денсітометріровать плями на платівках з непрозорою підкладкою.
Для виявлення і виділення розділених речовин застосовують добре розроблені методи, використовувані при хроматографування на папері, включаючи методи двовимірного розподілу. Слід зазначити, що методи хроматографії та електрофорезу на папері засновані на абсолютно різні властивості речовин, що розділяються ж доповнюють один одного. Тому кращі результати дає поєднання цих двох методів. Найбільш широке застосування електрофоретичний метод отримав в біохімії, зокрема, для поділу сироваткових білків, гідролізату нуклеїнових кислот, амінокислот і пептидів.
Змінити хімічним шляхом природу частково розділених речовин перед проявом у другому напрямку з використанням колишніх нерухомої і рухомої фаз.
В окремих випадках для локалізації розділених речовин можна використовувати такі реактиви, які не заважають подальшого застосування (після екстракції плям) другий кольоровий реакції, необхідної для колориметрического визначення. Для другої кольорової реакції застосовують інший реактив, який діє на іншу функціональну групу визначається з'єднання. Так можна розділяти ефіри жирних кислот, локалізувати їх парами йоду і після прояву кількісно визначити колориметрически, перевівши ефіри в пофарбовані залізні комплекси гід-роксамових кислот[37](Див. Стор. Відтворюваність методу була перевірена на суміші метилових ефірів пальмітинової, 6-оксистеаринової і 910-діоксістеаріновой кислот. Цим же методом були проаналізовані суміші моно -, ді - і тригліцеридів[37](Пор. Гліколіпо-ідние фракції липоидов мозку були пофарбовані аміачним розчином бром-тимолового і визначені колориметрически після екстракції антронсерной кислотою[17](Пор. Фракції ліпідів людської плазми[11]І сфінгоміеліновие компоненти липоидов мозку[17]Були пофарбовані на хроматограмі аміачним розчином бромтимолового синього і Озол, і потім в їх зоні колориметрически визначено вміст фосфору (пор.
На шарі сорбенту локалізують зони розділених речовин і навколо обумовленою зони повністю видаляють сорбент, знімаючи його з пластіпкі борозенкою в формі кільця. В утворену виїмку поміщають еластичну і непровідну прокладку, а до неї прикріплюють полярографическую осередок оригінальної форми так, щоб її нижня площина щільно прилягала до поверхні шару сорбенту. В утворену порожнину подають відповідний електроліт і проводять далі визначення звичайним способом. Обсяг електролітичної осередки, утвореної скляної підкладкою, ізолюючої прокладкою (наприклад, із силіконової гуми) і поверхнею держателя електродів, становить 100 - 200 мкл. Робочий електрод виготовляють переважно з вуглецевої ласти.
Відомий ряд пристроїв для детектування розділених речовин безпосередньо на ТШХ-платівці. Ді Сте-Фано і Марини[18]запропонували кондуктометрический детектор для паперової, тонкошарової та колонкової хроматографії. Міст Уітсто-на пов'язаний з підсилювачем, вихідний сигнал якого надходить на самописець.
Встановлюють температуру випарника і відбору розділених речовин і температуру колонки.
Другий спосіб передбачає попереднє виморожування розділених речовин з елюата (з використанням мікропрепаратівних методів) і їх подальше нанесення на старт тонкошарової пластинки.
В окремих випадках для локалізації розділених речовин можна використовувати такі реактиви, які не заважають подальшого застосування (після екстракції плям) другий кольоровий реакції, необхідної для колориметрического визначення. Для другої кольорової реакції застосовують інший реактив, який діє на іншу функціональну групу визначається з'єднання. Так можна розділяти ефіри жирних кислот, локалізувати їх парами йоду і після прояву кількісно визначити колориметрически, перевівши ефіри в пофарбовані залізні комплекси гід-рок Самовіа кислот[37](Див. Стор. Відтворюваність методу була цроверена на суміші метилових ефірів пальмітинової, 6-оксистеаринової і 910-діоксістеаріновой кислот. Цим же методом були проаналізовані суміші моно -, ді - і тригліцеридів[37](Пор. Гліколіпо-ідние фракції липоидов мозку були пофарбовані аміачним розчином бром-тимолового і визначені колориметрически після екстракції антронсерноі кислотою[17](пор. Фракції ліпідів людської плазми[11]і сфінгоміеліновие компоненти липоидов мозку[17]були пофарбовані на хроматограмі аміачним розчином бромтимолового Синього і Озол, і потім в їх зоні колориметрически визначено вміст фосфору (пор.
Хроматограмма суміші пестицидів, записана за допомогою рефрактометричних детектора (розчинник - ізооктан. витрата 0 8 мл /хв. колонка довжиною 1 2 м. Оскільки випливає з колонки розчинник містить розділені речовини, багато з яких мають специфічні групи, здатні поглинати, для детектування був запропонований ряд спектральних методів, заснованих на вимірах поглинання світла речовиною в певній частині спектра, наприклад в ультрафіолетовій або інфрачервоної області. Оскільки детектування проводиться безперервно і неможливо здійснити вимір у всьому спектрі поглинання, знімають лише поглинання при фіксованій довжині світлової хвилі, яку вибирають таким чином, щоб детектор був придатний для вимірювання можливо більшої кількості речовин.
Якщо, проте, можна локалізувати розділені речовини без їх подальшого перетворення, наприклад за їхньою власною флуоресценції або з поглинання в ультрафіолеті на пластинках, покритих флуоресцирующим складом, і якщо після екстракції речовини є в кількостях, достатніх для застосування фізико-хімічних методів визначення, то цю можливість зазвичай використовуватись.
Хроматограмма суміші пестицидів, записана за допомогою рефрактометричних детектора ( розчинник - ізооктан, витрата 0 8 мл /хв. колонка довжиною 1 2 м. Оскільки випливає з колонки розчинник містить розділені речовини, багато з яких мають специфічні групи, здатні поглинати, для детектування був запропонований ряд спектральних методів, заснованих на вимірах поглинання світла речовиною в певній частині спектра, наприклад в ультрафіолетовій або інфрачервоної області. Оскільки детектування проводиться безперервно і неможливо здійснити вимір у всьому спектрі поглинання, знімають лише поглинання при фіксованій довжині світлової хвилі, яку вибирають таким чином, щоб детектор був придатний для вимірювання можливо більшої кількості речовин.
Якщо, проте, можна локалізувати розділені речовини без їх подальшого перетворення, наприклад за їхньою власною флуоресценції або з поглинання в ультрафіолеті на пластинках, покритих флуоресцирующим складом, і якщо після екстракції речовини є в кількостях, достатніх для застосування фізико-хімічних методів визначення, то цю можливість зазвичай слід використовувати.
Дуже часто для отримання достатньої кількості розділених речовин потрібно кілька разів повторювати один і той же цикл поділу. У зв'язку з цим великі зусилля були витрачені на автоматизацію процесу збору розділених речовин. На жаль, така автоматизація можлива лише в разі відносно простих розділень, які виконуються за допомогою звичайних методів. Суміші ж, використовувані в дослідних лабораторіях, часто настільки цінні, що втрати розділених речовин, що відбуваються при переключення автоматичного пристрою для відбору фракцій, абсолютно неприпустимі. Успішна автоматизація можлива лише в разі абсолютно стабільною нульової лінії детектора. Програмування температури колонки ще більше ускладнює справу. Розглянемо, наприклад, хроматограму поділу ефірного масла, наведену на рис. 722. Якщо пороговий рівень - перемикання пристрою для відбору фракцій встановити на рівні, рівному 5% повного відхилення пера самописця (це не такий вже високий рівень), то буде втрачено можливість відбору малих хромато-графічних піків. Можна встановити різні рівні для різних піків, але це очевидно можна зробити лише після ретельного хроматографирования даної суміші.
Другою важливою технічною проблемою є уловлювання розділених речовин при великих витратах газу-носія.
Існує й інший універсальний спосіб детектування розділених речовин. При приготуванні пластинок для тонкошарової хроматографії до адсорбентів додають неорганічний фосфор і таким чином отримують флуоресцирующие пластинки.
Уловлювання та збір на виході колонки вже розділених речовин представляє деякі труднощі. Розділені речовини знаходяться в паровій фазі, для уловлювання їх необхідно скондесувати. На виході колонки для цього використовують спеціальні збірники фракцій, що представляють собою ємності, заповнені інертним насадкою. Збірник охолоджується будь-яким хладоагентом, найчастіше рідким азотом. Незважаючи на низьку температуру, при якій відбувається збір фракцій, повна конденсація зазвичай не досягається. При різкому охолодженні частина речовини несеться у вигляді туману або кристаликів потоком газу-носія.
Що випливає з колонки потік розчинника з розділеними речовинами потрапляє насамперед у вузол дозування, в якому відміряються дози певної величини для подальшої подачі в систему пробірок для збору фракцій. Дозування може здійснюватися але обсягом, за вагою або за часом. Дозування за об'ємом здійснюється або з використанням сифона, обсяг якого строго заданий і може змінюватися лише з заміною осередки, або з використанням дозування зі зміною положення по висоті контакту для електропровідних розчинів з відкриванням крана в момент замикання ланцюга. При дозуванні за часом через задані проміжки часу відбувається переміщення пробірок для збору фракцій.
Що випливає з колонки потік розчинника з розділеними речовинами потрапляє насамперед у вузол дозування, в якому відміряються дози певної величини для подальшої подачі в систему пробірок для збору фракцій. Дозування може здійснюватися за обсягом, за вагою або за часом. Дозування за об'ємом здійснюється або з використанням сифона, обсяг якого строго заданий і може змінюватися лише з заміною осередки, або з використанням дозування зі зміною положення по висоті контакту для електропровідних розчинів з відкриванням крана в момент замикання ланцюга. При дозуванні за часом через задані проміжки часу відбувається переміщення пробірок для збору фракцій.
Як уже згадувалося, недоцільно проводити фарбування розділених речовин на хроматограмі, після чого пофарбовані речовини екстрагувати і фотометріровать. Проте цей метод був використаний Бар-Рольє[2]при кількісному поділі амінокислот по Бреннеру і Нідер-Визеру[31, причем, по-видимому, с успехом. Данные о воспроизводимости этого метода анализа не приведены.
Кроме перечисленных выше методов для идентификации хроматографически разделенных веществ, могут быть использованы кулонометрия, полярография, спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях, обычный анализ элементарного состава и др. При отсутствии перечисленных дорогостоящих приборов во многих случаях можно воспользоваться классическими методами качественного анализа.
Как уже упоминалось, нецелесообразно проводить окрашивание разделенных веществ на хроматограмме, после чего окрашенные вещества экстрагировать и фотометрировать. Тем не менее этот метод был использован Бар-ролье[2]при кількісному поділі амінокислот по Бреннеру і Нідер-Визеру[3], Причому, мабуть, з успіхом.
Схема приладу для безперервної ГЖРХ, описаного Шут-те і Коендерсом. Шутт і Коендерс розробили систему, в якій розділені речовини розчиняються в потоці сцінтіл-тора.
На рухомий шар наносять пробу, поділяють, розділене речовина видаляють з стрічки і, нарешті, використаний адсорбент соскребают.
Потім в цих фракціях виявляють або кількісно визначають розділення речовини відповідними хімічними або фізичними методами. При знятті такої рідкої хроматограми більш сильно адсорбовані речовини з'являються в елюаті пізніше, ніж менш сильно адсорбовані.
Для елюціі вибирають такий розчинник, в якому розділені речовини добре розчинні і стійкі. Вода (якщо необхідно, з добавкою кислоти або аміаку) служить прекрасним розчинником, якщо тільки задовольняє обом цим умовам. Якщо необхідно скористатися менш полярними розчинниками, слід брати до уваги адсорбцію речовини.
Потім в цих фракціях виявляють або кількісно визначають розділення речовини відповідними хімічними або фізичними методами. При знятті такої рідкої хроматограми більш сильно адсорбовані речовини з'являються в елюаті пізніше, ніж менш сильно адсорбовані.