А   Б  В  Г  Д  Е  Є  Ж  З  І  Ї  Й  К  Л  М  Н  О  П  Р  С  Т  У  Ф  Х  Ц  Ч  Ш  Щ  Ю  Я 


Корнберг

Корнберг, використовуючи як матрицю природну ДНК, здійснив синтез біологічно активної ДНК.

Дезоксирибонуклеозид-5 - трифосфат, мічений[32Р ]в а-положенні. Корнберг і його колеги, вивчаючи питання про те, навіщо ДНК-полімерази необхідна присутність ДНК, знайшли, що ця ДНК виконує в полімеразної реакції дві найважливіші функції-вона служить запалом і матрицею.

Корнберг і його співробітники[51, 149]припустили, що механізм, обумовлює затравочную активність такого оліго- нуклеотиду, як д (А - Т), носить наступний характер (фіг. На першому етапі відбувається реплікація матриці причому утворення нового ланцюга починається з З - гідроксильного кінця матриці. Потім знову утворена спіраль плавиться і знову віджигається таким чином, що в результаті звільняється ділянку матриці роблячи можливим подальшу реплікацію. в результаті такого зісковзування нова ланцюг зсувається вздовж матриці відразу на ціле ланка AT, що забезпечує умови для правильного освіти пар основ. Процес цей строго залежить від температури: в той час як д (А - Т) 4 найкраще працює як приманка при 10 д (А - Т) набагато продуктивніше при 37 оскільки він пов'язаний зі своєю реплікою безліччю водневих зв'язків, що ускладнює ковзання .

Корнберг: В ході катаболічних процесів з харчових джерел вуглецю утворюються взаимопревращающихся проміжні продукти центральних шляхів обміну; анаболічні ж шляху являють собою послідовності ферментативних реакцій, в процесі яких з цих проміжних продуктів утворюються будівельні блоки, що входять до складу макромолекул.

Корнбергом), крім полімеру спеку активності володіє ще двома типами екзонуклеазноі активності: як 5 - - З - екеонуклеаза вона здійснює з 5-кінців дволанцюжкових ДНК деградацію, в результаті якої відбувається відщеплення 5 -моно - і 5 -фосфорілірован-них коротких олнгонуклеотідов, а як 3 - 5 -екзонуклеаза послідовно відщеплює 5 -мононуклеотіди з З - решт дволанцюжкових і одноланцюгових ДНК.

Макромолекулярні характеристики. Реакція Корнберга протікає при рН 7.5 в присутності610 - 3М магнію. Рівновага в цій реакції сильно зміщена в бік синтезу, бо навіть дуже низька концентрація мономерів (10 - 5М) призводить до практично повного витрачання мономеру. Це видно, якщо застосовувати пирофосфат мічений Р32 Поступово нуклеозидтрифосфат також метятся, і швидкість цієї реакції стає близькою до швидкості синтетичної реакції Корнберга.

Фермент Корнберга залучає бромурідінтріфосфат в полімеризацію з аденозинтрифосфату 1 і в результаті виходять змішані ланцюжки. Переконатися в цьому неважко, застосовуючи метод ультрацентрифугирования в градієнті щільності. Ця різниця в щільності настільки велике, що застосування методу Месель-сона тут вельми просто. Експеримент відмінно підтвердив написане вище рівняння і тим самим показав, що синтез ДНК в реакції Корнберга йде також шляхом редуплікації і поділу подвійних спіралей, як це з переконливістю було показано для біосинтезу ДНК у клітині.

Синтез Корнберга на затравки або, як вважають за краще говорити, на матриці знаходить просте пояснення з точки зору цієї моделі.

Синтез Корнберга на затравки або, як вважають за краще говорити, на матриці знаходить просте пояснення з точки зору цієї моделі. Позначимо буквами ділянки макромолекули з аденін через А, з гуаніном через G, з тиміном через Тис цитозином через С, а водневі зв'язку - пунктиром з трьох точок.

У лабораторії Корнберга отримані дані про близьку подібність між запалом і новоствореної ДНК. Чотири нуклеотиду ДНК можуть бути з'єднані 5 - - 3 -зв'язком, утворюючи лише 16 різних динуклеотидів. Ці дінуклеотід названі найближчими сусідніми парами підстав. Можна визначити частоту, з якою ці різні дінуклеотід зустрічаються в ДНК, синтезованої при використанні безклітинних екстрактів. ДНК-поли-Мераз каталізує етерифікацію фосфату, приєднаного до С-5 - атому дезоксирибози, що входить до складу нуклеозідтріфос-фатов. Цей фосфат з'єднується ефірним зв'язком з С-3 - атомом дезоксирибози іншого нуклеотиду. Якщо подіяти ДНК-полімеразою на ТТФ, дАТФ, дЦТФ і дГТФ32 і гідролізувати отриману ДНК до утворення нуклеотид - З - фосфатів, то мічений фосфор перейде від дГТФ32 до всіх тих нуклеотидам, з якими дГТФ32 був з'єднаний 5 - З - зв'язком. Вимірюючи вміст радіоактивного фосфору в кожному з чотирьох нуклеозид-3 - фосфатів, можна визначити частоту повторюваності різних найближчих до гуаніну сусідніх пар основ. Подібні дані отримані і для інших підстав.

У роботі Корнберга[39]були отримані мутанти Enterobacteriaceae (S. На підставі цього факту було зроблено припущення про відсутність у мутантів ферменту, що виконує анаплеротіческую функцію. Справді мутанти відрізнялися від дикого типу відсутністю у них фосфопіруваткарбоксілази (фермент 2 на фіг.

Ще Кребс і Корнберг відзначали, що, незважаючи на величезну різноманітність харчових речовин (білки, жири, вуглеводи), число хімічних реакцій, що забезпечують їх перетворення (розпад) і утворення енергії, дивно мало .

Синтез ДНК (Корнберг) відбувається при наявності в системі: ДНК - полімерази, всіх чотирьох дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ і ТТФ) і мінімальної кількості ДНК-затранкі. при цьому звільняється пирофосфат. Синтезируемая ДНК точно відповідає ДНК затравки. ДНК запал функціонує як матриця для своєї власної реплікації шляхом поділу двох ниток і утворення навколо кожної з них нової нитки з комплементарним (стор. . У 1957 році Корнберг здійснив синтез ДНК вбезклітинних системі яка мала нуклеотиди всіх чотирьох типів, фермент полімеразу і ДНК для затравки. Виявилося, що ДНК, що утворилася в процесі ферментативного синтезу, завжди ідентична ДНК, використаної в якості затравки.

Якщо діяти ферментом Корнберга на суміш мономерів, що містить тільки Г і Ц, то результат виявиться трохи іншим: виходять в рівній кількості гомополімери поли - Г і поли - Ц, що утворюють подвійні спіралі шляхом комплексообразова-ня.

Істотні відмінності синтезу Корнберга від синтезу Очоа і Грінберг-Манаго полягають (крім субстрату і ферменту) в наступному.

Модель ділянки молекули ДНК (а і схема структури ДНК у вигляді спіральних сходів (6 де ступені зображують піримідинові і пури-нові підстави, пов'язані водневими зв'язками (по Уот-сону і Крику. Істотні відмінності синтезу Корнберга від синтезу Очоа і Грін-берг - Манаго полягають (крім субстрату і ферменту) в наступному. Синтез Очоа і Грінберг-Манаго може бути здійснений з індивідуальним пирофосфатом нуклеозида або з сумішшю таких пірофосфатів.

Робертсон, Хартвелл і Корнберг[35]знайшли, що діетил-дігептілеульфід, а також іприт окислюються до відповідних сульфоксидів киснем повітря в присутності ненасичених жирних кислот і їх похідних. В якості останніх застосовувалися висихають масла, як, наприклад, лляне і оливкова. Новоутворена перекис окисляє сульфід до сул'-фоксіда, реакція завершується менш ніж за годину. У присутності надлишку перокоідірованного ефіру жирної кислоти, наприклад етіллінолеата, окислення сульфідів протікає приблизно стехіометрично - один моль перекисного кисню витрачається на моль сульфіду. Якщо ж сульфід узятий в надлишку, то сульфіду зникає значно більше, ніж є перекису. Автори припускають, що в цих випадках або газоподібний кисень не був повністю вилучений з реакційної суміші або ж утворювався менш окислений продукт, ніж сульфоксид. Спеціальними дослідами було встановлено, що іприт за відсутності ненасиченої кислоти не утворює продуктів окислення протягом року. Ці дані можуть мати значення при з'ясуванні характеру дії сульфідів як інгібіторів окислення.

ДНК-нуклеотіділтранс-феразим, або фермент Корнберга (ДНК-полімераза I), який здійснює полімеризацію дезоксирибонуклеозидтрифосфатов на ДНК-матриці в присутності іонів Mg2 - Виділений з кишкової палички після ретельного очищення фермент являє собою препарат, гомогенний за критеріями седиментации, хроматографії та електрофорезу в крохмальної гелі. Поряд з полімеразної активністю фермент володіє також екзонуклеазной активністю.

Цей цикл був вперше запропонований Корнбергом і Кребсом в 1957 р для пояснення зростання ряду мікроорганізмів (дріжджів, багатьох цвілі Escherichia coli та Pseudomonas) на середовищі що містить в якості єдиного джерела вуглецю таке дво-вуглецеве з'єднання, як оцтова кислота.

Спрощена схема механізму реплікація ДНК по Корнбергу.

Надалі було встановлено, що полімераза Корнберга є скоріше репаразой - повільно чинним ферментом, що заповнює прогалини в полінуклеотидних блоках. In vivo працює справжня полімераза. Ми ще мало знаємо про ці ферментах.

Для здійснення цієї реакції придатний фермент, названий Корнбергом ДНК-полімеразою. В даний час подібний фермент отриманий з багатьох бактерій п з тканин вищих тварин.

Таким чином, гліоксилатний цикл (або цикл Кребса - Корнберга) являє собою приклад анаплеротіческой ланцюгова реакція.

Дуже цікаві і вельми важливі результати були отримані в лабораторії Корнберга по синтезу ДНК. У цій лабораторії було виділено новий фермент полімераза, який виявився здатним in vitro (поза організмом) каталізувати синтез полінуклеотидів типу ДНК. Цей фермент викликає полімеризацію нуклсотідіих одиниць тільки дезоксірібозной природи. Синтезовані в лабораторних умовах за допомогою ферменту полідезоксірібонуклеотіди за своїми фізичними і фізико-хімічними властивостями не відрізнялися від природних, пативністю ДНК, що говорило про спільність їх макромолекулярной структури.

Відомо[65], Що для синтезу тимідину необхідна фолевая кислота; в роботах Корнберга та інших дослідників, про яких мова буде нижче, підкреслюється участь в цьому процесі окси-метілтетрагідрофолевой кислоти (СН2ОН - ТГФ), формула якої приведена на фіг.

В 1967 році газети всього світу обійшло спільнота-ие, про те, що Корнберг синтезував живу молекулу, то, звичайно, нісенітниця. живих молекул не буває, життя Виникає лише в результаті взаємодії цілої со-окупність різних молекул, різних речовин. Але Корнберг дійсно зробив дуже хорошу роботу.

Відзначимо цікаву реакцію метілкетони з бензальаніліном в присутності BF3 яка була вивчена Снайдером, Корнбергом і Роміг[120]і є простим методом отримання (З - амінокетони.

Відзначимо цікаву реакцію метілкетони з бензальані-лином в присутності BF3 яка була вивчена Снайдером, Корнбергом і Роміг[120]і є простим методом отримання[3-аминокетонов.
Большой вклад в решение проблемы биологического синтеза высокополимерных нуклеиновых кислот из мононуклеотидов внесли работы Очоа и Корнберга.
Ферментативный синтез полидезоксинуклеотидов из дезоксину-клеозид-5 - трифосфатов ( сопровождающийся выделением неорганического пирофосфата) был впервые осуществлен Корнбергом и его сотрудниками[6]за допомогою ферменту з Escherichia зі /р Ця система, яка, ймовірно, дуже схожа на биосинтетические системи in vivo, вимагає присутності всіх чотирьох основних нуклеозид-5 - трифосфатов і дезоксирибонуклеїнової кислоти в якості затравки, а також іонів магнію. По ряду хімічних (включаючи співвідношення підстав), біохімічних і фізичних властивостей продукт (молекулярна вага - 510) відрізняється від затравочной ДНК, навіть якщо склад суміші субстратів сильно відрізняється від складу затравки. Спорідненість до субстрату надзвичайно велике.

Цікаво було перевірити наявність того ж механізму напівконсервативної редуплікаціі в лабораторній моделі - ферментативном синтезі ДНК по Корнбергу. Для цього був обраний в якості матриці або затравки, регулярний полімер АТАТАТ, а в якості мономерів - суміш трифосфатов аденозину і 5 - 6ром - уридину. Останній є замінником тимідину, так як дає водневі зв'язку з аденін.

Вершиною мистецтва многостадийного синтезу можна назвати отримання поли-нуклеотидів: гена аланяновой РНК Цораєв) і біологічно активної ДНК (Корнберг), ряду сеськвітерпенов і простагландинів (Коря), стероїдів і алкалоїдів (Вудвард), пешщіллвнов (Шихан), з'єднань із каркасною структурою (Шлейер , Пті Пакетта) і ін. Автори цих синтезів - видатні вчені багато з яких були удостоєні Нобелівської прении за успіхи в області органічного синтезу.

Розподіл изотопной мітки (тритію в подвійних ланцюгах ДНК (хрестики - ізотопна мітка. Нарешті в самий останній час ймовірність описаної структури ДНК і механізму її подвоєння була експериментально підтверджена в лабораторіях Доті і Корнберга. Той факт, що подібні денатуровані молекули ДНК є більш ефективної запалом, ніж нативні подвійніспіралі показує, що синтез Корнберга йде шляхом сорбції мононуклеозідтріфосфатов на одиночній ланцюга ДНК. У зв'язку з цим цікаво було випробувати в якості матриці ДНК з бактеріофага ФХ174 яка складається з одиночних ниток. Виявилося, що ця ДНК є, в згоді з очікуваннями, вдвічі ефективнішою запалом, ніж звичайна ДНК зі структурою подвійної спіралі. Останнім часом виявлено, що більш ретельне очищення ферменту Корнберга робить його нездатним до використання подвійних спіралей в якості матриць. Мабуть, існує окремий фермент, провідний попередньо процес поділу подвійних спіралей на поодинокі нитки, після чого вони реду-плпціруются за принципом комплементарності.

Важливе значення мав відкритий Очоа і Грінберг-Манаго ферментативний метод синтезу полирибонуклеотидов з нуклеотиду і аналогічний синтез полідезоксірібонуклеотідов з дезоксинуклеозидов-5 - три-фосфатів, здійснений Корнбергом.

В останні роки наведені вище уявлення про будову нуклеїнових кислот були в деякій мірі підтверджені ферментативним синтезом РНК (Очоа із співробітниками) і ДНК (Корнберг); вихідними продуктами служили нуклеозідполіфосфати, які відщеплювали фосфорну (або пірофосфорна) кислоту і мононуклеотиди з'єднувалися з утворенням речовин, досить близьких за властивостями природних РНК і ДНК.

Корнбергу вдалося вперше синтетично отримати копію ДНК бактеріофага.

Корнбергу вдалося вперше синтетично отримати копію ДНК бактеріофага. Правда, слід зазначити, що в якості матриці для синтезу була використана вже готова молекула ДНК.

Синтез ДНК вбезклітинних системі вперше був здійснений А. Корнбергом, удостоєним за ці роботи Нобелівської премії в 1959 р Для проведення синтезу необхідно п'ять істотних компонентів. Крім ферменту необхідні: адено- зінтріфосфат (АТФ), що є джерелом енергії, Mg, ДНК-запал і Монофосфат всіх чотирьох нуклеозидов, що входять в ДНК - Після того як було показано, що під дією ферментів кіназ дезоксінуклеозідмонофосфати перетворюються в відповідні дезоксинуклеозидтрифосфатов, в експериментах почали додавати нуклеозидтрифосфат. Саме по відношенню до них активна полімераза.

Найбільш широко поширена з них-це ДНК-поліме-рази I, той фермент, який був описаний вище. Хоча Корнберг показав, що цей фермент здатний реплицировать в пробірці цілу молекулу ДНК дрібного вірусу фХ174 з утворенням біологічно активної дочірньої ДНК, ми знаємо, що ДНК-полімераза I-це не головний фермент, який здійснює елонгацію ДНК в клітині. ДНК-полімераза I дійсно бере участь в реплікації, але, як ми побачимо пізніше, особливим чином.

Одна з двох молекул утворилася С4 - кислоти використовується для регенерації Оксана-ацетату в циклі Кребса, а освіту другий молекули відображає результуючий синтез С4 - кислоти за рахунок двох ацетильних одиниць. Дійсно, Корнберг і Кребс, які запропонували цей цикл, відзначили, що він добре пояснює накопичення лимонної, фумарової та інших кислот, яке має місце в культурах деяких мікроорганізмів при їх вирощуванні на ацетат.

Сьогодні завдяки зусиллям Корнберга і багатьох інших дослідників ми знаємо, що для реплікації необхідна не тільки ДНК-полімераза. У цьому процесі мабуть, беруть участь більше двадцяти різних ферментів і білків, кожен з яких виконує певну функцію, Реплікація складається з великого числа послідовних етапів, які включають впізнавання точки початку реплікації, розплітання батьківського дуплекса, утримання його ланцюгів на достатній відстані один від друга, ініціацію синтезу нових дочірніх ланцюгів, їх елонгацію, закручування ланцюгів в спіраль і нарешті терминацию реплікації. Всі ці етапи процесу реплікації протікають з дуже високою швидкістю і винятковою точністю. Весь комплекс, що складається більш ніж з двадцяти реплікативних ферментів і факторів, називають ДНК-решіказной системою, або реплісомой.

Докази комплементарності і антипаралельності двох ланцюгів були отримані методом визначення частот найближчих сусідів (див. Стор. Досліди, проведені Джосс і Корнбергом, переконливо свідчать на користь першої з цих двох альтернатив (див. Стор. Перейдемо тепер до випадків, коли іони металу утворюють більш-менш міцні з'єднання з субстратом, причому в нинішньому проміжному комплексі валентність металу залишається незмінною. Сюди відносяться ефекти, що спостерігалися Корнбергом[4], що досліджували реакції декарбоксилювання кетокислот: щавелевоянтарной і ща-велевоуксусной. Іони алюмінію прискорюють реакцію декарбоксилювання, утворюючи нестійкі комплекси з цими кислотами . Спектрофото-метричний метод, застосований Корнбергом, дозволив йому прийти до висновку, що алюміній надає сильне поляризующее дію на кетокислот, утворюючи з ними нестійкі сполуки типу хелатів. Іони калію і натрію, як показав Кронін, прискорюють процеси конденсації, зокрема, реакцію між а-карбоксіціклогексаноном і ці-ленбромідом. Реакція прискорюється іонами натрію; калій діє набагато слабкіше. Це дає автору підставу для твердження, що механізм реакції пов'язаний з утворенням проміжних хелатов. Відомо, що іон калію має набагато менш вираженою тенденцією до утворення хелатів, ніж іон натрію.

Однак при сполученні зверненої реакції з реакцією синтезу крохмалю сумарна реакція, як показують термодинамічні розрахунки (AF - 2300 кал), веде до синтезу цього полісахариду. До того ж, як показав Корнберг[98], Ферментативні реакції, в результаті яких звільняється неорганічний пірофосфат, по суті можна розглядати як незворотні внаслідок того що відбувається ферментативний гідроліз ФФН (& F - 6700 кал)[14]; таким чином, сумарна реакція призводить до синтезу.

У образующемся продукті відтворюється та ж послідовність нуклеотидів, що і в ДНК-затравки. Цей факт був встановлений в лабораторії Корнберга[18, 20]шляхом аналізу найближчого сусідства (див. стор. ДНК і всіма чотирма дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, причому один з них, наприклад дАТФ, містить Р32 в першому (самому внутрішньому) залишку фосфорної кислоти. В процесі синтезу нової ДНК Р32 утворює місток між нуклеозидом нашого міченого трифосфата ( А) і сусіднім йому нуклеотидом, що містить невідоме підставу Z і знаходяться на зростаючому кінці поли-нуклеотидной ланцюга (фіг. Після завершення синтезу ДНК виділяють і розщеплюють ДНК-азой з микрококков (стор.

Залежність температури. Цікаво, що точки плавлення спіралей ДНК , отриманої з найрізноманітніших організмів, починаючи від фага Т4 і закінчуючи зобной залозою теляти, добре лягають на пряму. Різниця в 4 не дивна: полімер Корнберга строго регулярний щодо порядку чергування ланок, а природні ДНК все нерегулярні.

Експериментальне вивчення і теоретичні розрахунки рівноваг мають дуже важливе значення і для відкритої живої системи, даючи опорну інформацію, без якої не можна обійтися. Так, вивчення редуплікаціі ДНК in vitro, реалізованої в дослідах Корнберга (див. § 8.7), необхідно для розуміння подвоєння ДНК в клітинах, що діляться, є відкритими системами.