А   Б  В  Г  Д  Е  Є  Ж  З  І  Ї  Й  К  Л  М  Н  О  П  Р  С  Т  У  Ф  Х  Ц  Ч  Ш  Щ  Ю  Я 


Конкурентна елюція

Конкурентна елюція вносить додатковий етап селективного відбору шуканого речовини, що може істотно підвищити ступінь його очищення, особливо в тому випадку, коли воно було фіксовано на сорбенті що володіє груповий специфічністю. Однак цей метод має і свої недоліки.

Описані випадки, коли здійснення конкурентної елюціі вимагає внесення в елюент не одного, а двох реагентів. Очевидно, що в цих випадках речовина знімається з сорбенту тільки у вигляді потрійного комплексу.

Якщо елюент доріг (при конкурентній елюціі), а обрана відносно довга колонка, то можна скористатися імпульсної елюція: подати на верхню частину колонки, де сорбированная речовина, відносно невеликий обсяг такого елюента, свідомо знімає речовина з сорбенту, а потім продовжити елюція вже буфером.

Було відмічено, що в результаті цього поліпшується якість очищення і фракціонування методом конкурентної елюціі цілого ряду ферментів.

Очищення аспарагінсінтета-зи з печінки щура на колонці голу-бій а троянди[Hongo, Sato, 1981 ]. Мабуть, ДНК-полімераза I зв'язується з барвником по ділянці приєднання трифосфатов, що обумовлює можливість конкурентної елюції, а ДНК-полімераза фага Т4 зв'язується десь в іншому місці. Біологічні відмінності двох ДНК-полімерази добре відомі: наприклад, друга з них (на відміну від першої) має цистеїн в активному центрі пні володіє екзонуклеазной активністю.

У тій же роботі дана пропис активації трезілхлорідом продажного, модифікованого гліцерілпропілсіланом силикагеля (LiChrosorb DIOL, фірма Merck), отримання на його основі N8 - (б-аміногексіл) - АМФ-силикагеля і аффинная хроматографія на ньому при високому тиску для поділу суміші БСА та двох дегідроге-зв шляхом афінної конкурентної елюції. Весь процес фракціонування займав 15 хв.

Очищення рецептора для 353 -трііодтіроніна (Т3 на колонці сефарози з іммобілізованим гормоном (текст ILatham et al., 1981]. У цій роботі цікаво відзначити підбір оптимального співвідношення кількості афінного сорбенту і білкового розчину. Недолік сорбенту, природно, веде до неповної екстракції рецептора, а надлишок ускладнює конкурентну елюція вільним гормоном і вимагає використання підвищеної концентрації дорогого препарату.

Термін аффинная елюція ми навмисно зберегли саме для цього випадку, щоб уникнути термінологічної плутанини, хоча його нерідко можна зустріти в літературі при описі процесів біоспеціфіческого конкурентної елюціі речовини з істинно афінних сорбентів.

Взагалі ретельну промивку афінного сорбенту перед його використанням, а особливо після тривалого зберігання слід передбачити в будь-якому варіанті афінної хроматографії. Це явище небезпечне не зменшенням ємності сорбенту (на частки відсотка), а тим, що перейшли в розчин молекули ліганда можуть виявитися на два-три порядки більш активними щодо зв'язування речовини, ніж іммобілізовані молекули. Це створює ситуацію конкурентної елюції в той момент, коли повинна відбуватися посадка речовини на сорбент. Результатом такої ситуації може виявитися помітне зменшення і навіть повна відсутність затримання речовини на сорбенті. Підтікання лігандів може відбуватися не тільки за рахунок відриву їх ковалентно пов'язаних молекул від матриці але і в результаті постененной десорбції тих молекул ліганда, що не були відмиті після посадки його на матрицю.

Афінний сорбент з групової специфічністю має явну перевагу в тому випадку, коли ставиться завдання не тільки очищення, але і поділу декількох речовин, наділених спорідненістю до одного і того ж ліганду. Якщо ступінь цього спорідненості не однакова для різних речовин групи або якщо вдається підібрати для них різні (специфічні) конкурентні елюентом, то поділ речовин може бути здійснено хроматографически, в ході їх почергової елюції з сорбенту, що не вдалося б зробити в разі лиганда, що володіє суто індивідуальною специфічністю. З позицій очищення одного речовини це ж стан справ можна сформулювати наступним чином: зниження вибірковості сорбції при використанні сорбентів з групової специфічністю часто вдається компенсувати за рахунок вибірковості аффинной конкурентної елюції.

Елюція розчином вільного Ліга-та з такою ж ступенем спорідненості до речовини, як у лиганда на сорбенті може бути успішно здійснена за рахунок багаторазового перевищення концентрації вільного ліганду в порівнянні з іммобілізованим. При будь-якому способі з сорбенту, як уже згадувалося, буде елюіровать суміш шуканого речовини з конкурентом, яку належить ще розділити за допомогою додаткової операції фракціонування, причому в першому з двох варіантів конкурентної елюціі це буде не просто суміш, а міцний біоспеціфіческого комплекс.